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厭氧培養(yǎng)方法介紹

 
厭氧性細(xì)菌的分離培養(yǎng)法 
 厭氧菌需有較低的氧化—還原勢(shì)能才能生長(zhǎng)(例如破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌需氧化—還原電勢(shì)降低**0.11V時(shí)才開始生長(zhǎng)),在有氧的環(huán)境下,培養(yǎng)基的氧化—還原電勢(shì)較高,不適于厭氧菌的生長(zhǎng)。為使培養(yǎng)基降低勢(shì),降低培養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十分必要的。現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多,主要有生物學(xué),化學(xué)和物理學(xué)3種方法,可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況而選用。  1.生物學(xué)方法 
    培養(yǎng)基中含有植物組織(如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等)或動(dòng)物組織(新鮮無菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等),由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而消耗氧氣(如肌肉或腦組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣,碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用,就是根據(jù)這個(gè)原理),組織中所含的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—還原電勢(shì)下降。 
     另外,將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個(gè)平皿內(nèi),利用需氧菌的生長(zhǎng)將氧消耗后,使厭氧菌能生長(zhǎng)。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌(如枯草桿菌),另一半接種厭氧菌,接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上,并用石蠟密封,置37恒溫箱中培養(yǎng)2~3d后,即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長(zhǎng)。  2.化學(xué)方法 
    利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì),將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收,或用還原氧化型物質(zhì),降低氧化—還原電勢(shì)。 
 (1)李伏夫(B.M.JIbbob)法 
    此法系用連二亞硫酸納(Sodium hydrosulphite)和碳酸鈉以吸收空氣中的氧氣,其反應(yīng)式如下: 
    Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02 
    取一有蓋的玻璃罐,罐底墊一薄層棉花,將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)(如系液體培養(yǎng)基,則直立于罐內(nèi)),**上端保留可容納1~2個(gè)平皿的空間(視玻罐的體積而定),按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸納及碳酸鈉各30g,在紙上混勻后,盛于上面的空平皿中,加水少許使混合物潮濕,但不可過濕,以免罐內(nèi)水分過多。若用無蓋玻罐,則可將平皿重疊正放在淺底容器上,以無蓋玻罐罩于皿上,罐口周圍用膠泥或水銀封閉(如圖1-5)。  (2)焦性沒食子酸法 
 焦性沒食子酸在堿性溶液中能吸收大重氧氣,同時(shí)由淡棕變?yōu)樯钭厣慕剐詻]食橙(Purpurgallin)。每l00cm3空間用焦性沒食子酸1g及10%氫氧化納或氫氧化鉀l0ml,其具體方法主要有下列幾種:  1)單個(gè)培養(yǎng)皿法: 
 將厭氧菌接種于血瓊脂平板。取方形玻璃板一塊,中央置紗布或棉花或重疊濾紙一片,在其上放焦性沒食子酸0.2g及10%NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿蓋,將培養(yǎng)皿倒置于其上,周圍以融化石蠟或膠泥密封。將此玻璃板連同培養(yǎng)皿放人37C溫箱培養(yǎng)24~48h后,取出觀察。 
 2)Buchner氏試管法: 
 取一大試管,在管底放焦性沒食子酸0.5g及玻璃珠數(shù)個(gè)或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養(yǎng)管放人大試管中,迅速加入20%NaOH溶液0.5ml,立即將管口用橡皮塞塞緊,必要時(shí)周圍封以石蠟,37培養(yǎng)24~48h后觀察(圖1-6)。  3) 玻罐或干燥器法: 
 置適量焦性沒食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面,將培養(yǎng)皿或試管置于隔板上,并在玻罐內(nèi)置美藍(lán)指示劑一管,從罐側(cè)加入氫氧化鈉溶液放于罐底,將焦性沒食子酸用紙或紗布包好,用線系住,暫勿與氫氧化鈉接觸,待一切準(zhǔn)備好后.將線放下,使焦性沒食子酸落人氫氧化納溶液中,立即將蓋蓋好;封緊,置溫箱中培養(yǎng)。  4)瑞(Wright)氏法: 
 將已接種細(xì)菌的培養(yǎng)管的脫脂棉塞在火焰中燒灼滅菌后,塞人管中離培養(yǎng)基1~1.5cm處,置適量焦性沒食子酸于其上,加入10%NaOH溶液2ml,迅速用橡皮塞將管口塞緊,以膠泥或石蠟嚴(yán)密封閉置溫箱中培養(yǎng)(圖1-7)。  5)史(Spray)氏法: 
 用圖1-8所示的厭氧培養(yǎng)皿,在皿底一邊置焦性沒食子酸,另一邊置氫氧化鈉溶液,將已接種的平皿翻蓋于皿上,并將接合處用膠泥或石蠟密封完全,然后搖動(dòng)底部,使氫氧化鈉溶液與焦性沒食子酸混合,置溫箱中培養(yǎng)。  6)平皿法: 
 置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間,上面的平皿接種細(xì)菌,下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液,用膠泥封固后,置溫箱中培養(yǎng)(圖1-9)。  7)硫乙醇酸鈉法  
硫乙醇酸鈉(HSCH2COONa)是一種還原劑,加入培養(yǎng)基中,能除去其中的氧或還原性物質(zhì),促使厭氧菌生長(zhǎng)。其他可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C、半胱氨酸等。  A.液體培養(yǎng)基法: 
 將細(xì)菌種人含0.1%的硫乙醇酸鈉液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24~48h后觀察,本培養(yǎng)基中加美藍(lán)液作為氧化還原的指示劑,在無氧條件下,美藍(lán)被還原成無色。  B.固體培養(yǎng)基法: 
 常采用特殊構(gòu)造的Brewer培養(yǎng)皿,可使厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)而形成孤立的菌落;操作過程是先將Brewer氏皿干熱滅菌,將溶化且冷卻**50℃左右的硫乙醇酸鈉固體培養(yǎng)基傾人皿內(nèi)。待瓊脂冷   凝后,將厭氧菌接種于培養(yǎng)基的中央部分。蓋上皿蓋,使皿蓋內(nèi)緣與培養(yǎng)基外圍部分相互緊密接觸(圖1-10)。此時(shí)皿蓋與培養(yǎng)基中央部分留在空隙間的少量氧氣可被培養(yǎng)基中的硫乙醇酸鈉還原,故美藍(lán)應(yīng)逐漸褪色,而外緣部分,因與大氣相通,故仍呈藍(lán)色。將Brewer氏培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱內(nèi),經(jīng)過24~48h后觀察。  3.物理學(xué)方法   #p#分頁標(biāo)題#e#
 利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法,以驅(qū)除或隔jue環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣,使其形成厭氧狀態(tài),有利于厭氧菌的生長(zhǎng)發(fā)育。    (1)厭氧罐法 
    常用的厭氧罐有Brewer氏罐,Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐(圖1-11)。將接種好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中,先抽去部分空氣,代以氫氣**大氣壓。通電,使罐中殘存的氧與氫經(jīng)鉑或鈀的催化而化合成水,使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個(gè)厭氧罐放人孵育箱培養(yǎng)。本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。  (2)真空干燥器法   
 將欲培養(yǎng)的平皿或試管放人真空干燥器中,開動(dòng)抽氣機(jī),抽**高度真空后,替代以氫、氮或二氧化碳?xì)怏w。將整個(gè)干燥器放進(jìn)孵育箱培養(yǎng)。  (3)高層瓊脂法   
   加熱融化高層瓊脂,冷**45℃左右接種厭氧菌,迅速混合均勻。冷凝后37℃培養(yǎng),厭氧菌在近管底處生長(zhǎng)。  (4)加熱密封法   
   將液體培養(yǎng)基放在阿諾氏蒸鍋內(nèi)加熱l0min,驅(qū)除溶解于液體中的空氣,取出,迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后,在培養(yǎng)基液面覆蓋一層約0.5cm的無菌凡士林石蠟,置37℃培養(yǎng)。此外,尚有搖振培養(yǎng)法,此處從略。  (5)二氧化碳培養(yǎng)法 
少數(shù)細(xì)菌如布氏桿菌(牛型)等,孵育時(shí),需大氣中添加5%~10%二氧化碳,方能使之生長(zhǎng)繁殖旺盛。常用的方法是置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng);**簡(jiǎn)單的二氧化碳培養(yǎng)法是在盛放培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi),燃點(diǎn)蠟燭,當(dāng)火焰熄滅時(shí),該缸的大氣中,就約增加了5%~10%的二氧化碳。也可用化學(xué)物質(zhì)作用后生成二氧化碳,如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4%NaHCO3與30%H2SO4lmL,則可產(chǎn)生22.4mL的二氧化碳?xì)怏w。