具體操作:
一. 傳代前準(zhǔn)備:
1.預(yù)熱培養(yǎng)用液:把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
2.用75%酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)和雙手。
3.正確擺放使用的器械:保證足夠的操作空間,不僅便于操作而且可減少污染。
4.點(diǎn)燃酒精燈:注意火焰不能太小。
5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶,放入微波爐內(nèi)高火,8分鐘再次消毒。
6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液:取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。
7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞:注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋,用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面,再在鏡下觀察細(xì)胞。
8.打開(kāi)瓶口:將各瓶口一一打開(kāi),同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。
二.胰蛋白酶消化:
1.加入消化液:小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗),加入適量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以蓋住細(xì)胞**好,**佳消化溫度是37℃。
2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞:倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞,若胞質(zhì)回縮,細(xì)胞之間不再連接成片,表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液:棄去胰蛋白酶液,注意更換吸管,加入新鮮的培養(yǎng)液。
三.吹打分散細(xì)胞:
1.吹打制懸:用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。
2.吸細(xì)胞懸液入離心管:將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心:平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中,以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6~8分鐘。
4.棄上清液,加入新培養(yǎng)液:棄去上清液,加入2ml培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
四.分裝稀釋細(xì)胞:
1.分裝:將細(xì)胞懸液吸出分裝**2~3個(gè)培養(yǎng)瓶中,加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細(xì)胞:倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量,必要是計(jì)數(shù)。注意密度過(guò)小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長(zhǎng),傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。**后要做好標(biāo)記。
五.繼續(xù)培養(yǎng):
用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶,適當(dāng)旋松瓶蓋,放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開(kāi)始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時(shí)為一個(gè)+,占50%為++,占75%時(shí)為+++。
傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng):
1.嚴(yán)格的無(wú)菌操。
2.適度消化:消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響,消化過(guò)程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化,一旦胞質(zhì)回縮,連接變松散,或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附:EDTA(0.02%乙二胺四乙酸二鈉)消化液配方:
EDTA 0.20g,NaCl 8.00g,KCl 0.20g,KH2PO4 0.02g,葡萄糖2.00g,0.5%酚紅4ml,加入蒸餾水定容**1000ml。10磅20min高壓滅菌,使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和,使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗,否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。